Applications de la PCR
La PCR est notamment utile quand on dispose de matériel génétique en faible quantité ou en mauvais état. Elle trouve de nombreuses applications dans :
le clonage et le séquençage génétique
le diagnostic de maladies génétiques
la détection de mutations
le dosage protéique
la détection des OGM
la détermination de filiation
le marquage de l'ADN
la réplication de l’ADN au cours du cycle cellulaire, mais aussi dans des processus de réparation et de recombinaison de l'ADN
L’amplification en chaîne par polymérase (ACP, PCR en anglais, le sigle français étant rarement employé) ou réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction en anglais) ou encore test d'amplification des acides nucléiques (TAN au Canada francophone) est une méthode de biologie moléculaire d'amplification génique in vitro
une membrane externe où la présence de nombreuses porines (protéines en forme de canaux) permet le passage de molécules
Elle permet de dupliquer en grand nombre (avec un facteur de multiplication de l'ordre du milliard) une séquence d'ADN ou d'ARN connue..à partir d'une faible quantité (de l'ordre de quelques picogrammes)..On peut ainsi, par exemple, détecter la présence du VIH ou mesurer une charge virale (concentration du virus dans le plasma), des traces d'OGM (organismes génétiquement modifiés),
les propriétés de synthèse enzymatique et d’initiation spécifique à l'ADN double brin spécifique des ADN polymérases dépendantes à l'ADN thermostables ;
les propriétés d’hybridation et de déshybridation des brins complémentaires d’ADN en fonction de la température.
Ces éléments permettent de contrôler l’activité enzymatique grâce à des transitions de température (assurées par un thermocycleur) répétées de manière cyclique (cf. réaction en chaîne).
De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces, plus fidèles…
Une polymérase est une enzyme capable d'enchaîner des nucléotides en polymères d'ADN (pour les ADN polymérases) ou d'ARN (pour les ARN polymérases). Il existe des polymérases chez les eucaryotes, les procaryotes et même chez les virus.
Ainsi, l'amplification obtenue est exponentielle, et à partir d'une molécule d'ADN, il est possible d'obtenir un milliard de copies de cette même molécule. Après électrophorèse, les molécules amplifiées (amplicons) peuvent être visualisées sur un gel d'agarose à l'aide de molécules fluorescentes (bromure d'éthidium ou Sybr Green
Les procaryotes possèdent plusieurs ADN polymérases, numérotées I, II et III, l'ADN polymérase III étant la plus active. Chez les eucaryotes, il existe différentes sortes d'ADN polymérases dont :
l'ADN polymérase alpha servant à la réplication de l'ADN dans le noyau ;
l'ADN polymérase bêta servant à la réparation de l'ADN, dans le noyau également ;
l'ADN polymérase gamma, présente dans les mitochondries.
la mitochondrie possède un génome à ADN
Ou ALORS
La technique d'électrophorèse classique en gel d'agarose ou de polyacrylamide permet de séparer des fragments d'ADN suivant leur taille. Sur ces gels constitués d'un réseau désorganisé de longues fibres, on dépose l'ADN dont les molécules sont chargées négativement. Soumises à un champ électrique, elles migrent vers le pôle. Celles qui sont plus petites que les mailles du réseau de fibres sont très peu freinées et migrent rapidement, tandis que les molécules plus grandes sont ralenties. Le pouvoir résolutif de l'électrophorèse est excellent pour des fragments d'ADN dont la taille est inférieure à 50 000 paires de bases (50 kilobases ou kb), mais, au−delà de cette taille, les fragments d'ADN ne sont plus séparés. Par exemple, l'ADN du bactériophage A (50 kb) et l'ADN des chromosomes de levure (de 500 à 2 000 kb) ne seront pas séparés par électrophorèse classique. L'électrophorèse en champ électrique pulsé a permis de résoudre ce problème, en utilisant un champ électrique discontinu ou bien en modifiant périodiquement la direction du champ. Dans ces conditions, le temps mis par la molécule d'ADN pour se positionner dépend de sa longueur. Ainsi, une molécule d'ADN très longue (2 000 kb) passera plus de temps à se réorienter qu'à se déplacer, tandis qu'une plus petite molécule (200 kb) passera plus de temps à migrer. Le repérage des fragments, après leur positionnement, fait appel à la technique d'hybridation moléculaire.
OU ENCORE
Le ciblage de l’ADN : les méganucléases
Les limitations de la recombinaison homologue ont poussé à chercher des méthodes plus efficaces. En effet, sur un autre front de la recherche, les techniques de séquençage de l’ADN, qui permettent de connaître l’ordre d’enchaînement des nucléotides, ont progressé d’une manière fulgurante, de sorte que l’on dispose de plusieurs milliers de génomes complets d’organismes différents, allant de l’hydre d’eau douce au mammouth. S’il en est besoin, on séquence un génome humain (enchaînement de 3 milliards de nucléotides) en quelques jours. En se fondant sur des algorithmes bio-informatiques, on sait déterminer les séquences qui sont probablement des gènes. À partir de la seule séquence de l’ADN d’un génome, on déduit l’existence de plusieurs milliers ou dizaines de milliers de gènes, dont on ne connaît en général pas la fonction. Sur la base de la séquence codante de ces gènes, on peut seulement attribuer une fonction plausible aux protéines pour lesquelles ces gènes codent. Les conclusions sur les fonctions des gènes, ainsi obtenues par traitement mathématique des séquences d’ADN et extrapolation à partir des fonctions de protéines connues, font-elles sens sur le plan de la physiologie de l’organisme ? En d’autres termes, dire qu’un gène d’oursin code pour une protéine qui ressemble à une protéine impliquée dans le développement des mammifères ne dit pas qu’il s’agit d’un gène du développement de l’oursin. La seule manière de le savoir est d’inactiver ce gène en y introduisant une mutation, le réintroduire dans l’animal, puis en observer les effets sur le développement et la physiologie de l’organisme. Mais cette tâche est difficile car la capacité d’analyse fonctionnelle des gènes a progressé bien moins vite que la connaissance des génomes. De plus, elle est pratiquement impossible à réaliser dans la plupart des organismes, comme l’oursin de cet exemple, par manque des outils génétiques et moléculaires nécessaires.
L’introduction de nouvelles technologies de modification rapide des génomes, connue sous le nom d’édition des génomes, [...]
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